DNA sekvenční zpracování
DNA sekvenční zpracování je proces stanovení nucleotide pořadí daného DNA fragmentu, volal DNA sekvenci. Nyní, téměř celé DNA sekvenční zpracování je vykonával použití řetězové zakončovací metody [1], vyvinutý Frederickem Sangerem. Tato technika používá sekvenci-specifické ukončení in vitro DNA syntéza používání reakce přizpůsobilo nucleotide substráty.
Sled DNA zakóduje nutnou informaci pro živé věci přežít a rozmnožit. Stanovení pořadí je proto užitečné v ' čistý ' výzkum do proč a jak organismy žijí, také jak v aplikovaných předmětech. Protože DNA je klíč ke všem živým věcem, znalost DNA sekvence může být užitečná v téměř nějaká biologická podřízená oblast. Například, v lékařství to může být používáno identifikovat, určit jako a potenciálně vyvinout léčby genetických chorob. Podobně, výzkum pathogens může vést k léčbám nakažlivých chorob.
Řetězová zakončovací metoda
V řetězech terminator sekvenční zpracování (Sanger sekvenční zpracování), rozšíření je zahájeno u specifického místa na šabloně DNA tím, že používá krátký oligonucleotide ' základ ' doplňkový k šabloně u té oblasti. Oligonucleotide základ je rozšířen používat DNA polymerase, enzym, který kopíruje DNA. Zahrnutý se základem a DNA polymerase jsou čtyři deoxynucleotide základy (DNA stavební kameny), spolu s nízkou koncentrací řetězu končit nucleotide (nejvíce obyčejně di -deoxynucleotide). Omezený incorporation řetězu končit nucleotide DNA polymerase výsledky v sérii příbuzných DNA fragmentů, které jsou skončily jen u pozic kde to zvláštní nucleotide je používán. Fragmenty jsou pak velikost-oddělený elektroforézou v desce polyacrylamide krystalizují, nebo více obyčejně nyní, v úzké skleněné trubce (kapilára) se plnila vazkým polymerem.
Klasická řetězová zakončovací metoda nebo Sanger metoda nejprve zahrne připravovat DNA být sequenced jako jediný prvek. DNA vzorek je rozdělen do čtyř oddělených vzorků. Každý čtyř vzorků má základ, čtyři normální deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP a dTTP), DNA polymerase, a jen jeden ze čtyř dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP) přidali se k tomu. Dideoxynucleotides jsou přidané omezené kvantity. Základ nebo dideoxynucleotides jsou jeden radiolabeled nebo mají světélkující přívěsek.
Jak DNA prvek je prodloužen DNA polymerase catalyses spojení deoxynucleotides k korespondenčním základům. Nicméně, jestliže dideoxynucleotide je spojený k základu, pak ten fragment DNA může už ne být prodlužován protože dideoxynucleotide chybí velmi důležitý 3 ' - Oh skupina. Fragmenty všech velikostí by měly být získány kvůli náhodnosti když dideoxynucleotide je přidán. Nicméně, ujistit se to všechny odlišné délky nastanou, jen krátké úseky DNA mohou být sequenced v jednom testu.
DNA je pak denatured a výsledné fragmenty jsou odděleny (s řešením spravedlivého nucleotide) gelovatět elektroforézu, od nejdelší k nejkratší. Každý čtyř DNA vzorků je útok na jednu z čtyř individuálních cest (cesty, T, G, C) spoléhat se na kterého dideoxynucleotide byly přidány. Spoléhat se na zda základy nebo dideoxynucleotides byli radiolabeled nebo fluorescently označili, DNA skupiny mohou být zachyceny vystavením rentgenům nebo UV-světlo a DNA sekvence mohou být přímo přečetl krystalizovat. V obraze vpravo, rentgenový film byl vystaven k sušil krystalizovat, a tmavé skupiny ukážou pozice DNA molekul odlišných délek. Tmavá skupina v cestě ukáže ukončení řetězu pro ten zvláštní DNA subunit a DNA sekvence může být přečetl jak naznačil.
Tam moci být různé problémy se sekvenčním zpracováním přes Sanger metodu. Základ používal moci také být žíhaný ke druhému místě. Toto by způsobilo dvě sekvence být interpretován současně. Toto může být řešeno vyššími annealing teplotami a vyšší G a C obsah v základě. Další problém může nastat když RNA kontaminuje reakci, který může fungovat jako základ a vedení ke skupinám ve všech cestách vůbec pozice kvůli non přesný připravovat. Jiný contaminants moci být od jiných plasmids, inhibitorů DNA pol a nízkých koncentrací oběcně. Sekundární struktura DNA bytí čteného DNA pol může vést k problémům četby a chtít být zobrazil na readout skupinami ve všech cestách jediný nemnoho pozic.
Jsou tam dva náhradník-druhy řetězu-sekvenční zpracování ukončení. V metodě originálu, nucleotide pořadí zvláštní DNA šablony může být odvozeno tím, že vykonává čtyři paralelní rozšiřovací reakce používat jednoho čtyři řetěz-končit základy v každé reakci. DNA fragmenty jsou zachyceny tím, že označí základ radioaktivním phosphorous předtím než vykonává reakci sekvenčního zpracování. Čtyři reakce by pak byly běh ven ve čtyřech přilehlých cestách na desce polyacrylamide krystalizují.
Vývoj této metody používal čtyři různé světélkující barvivo-označil základy. Toto má výhodu vyhýbat se potřebě radioaktivity; zvětšovat bezpečí a rychlost, a také že čtyři reakce mohou být spojené a vtékat jeden gelovatět cestu, jestliže oni mohou být rozlišováni. Tento přístup je znán jak ' barvit sekvenční zpracování základu '.
Barvivo terminator sekvenční zpracování
Alternativa k etiketování základu je k popisce terminators místo toho, obyčejně nazvaný ' barvivo terminator sekvenční zpracování '. Hlavní výhoda tohoto přístupu je to kompletní sekvenční zpracování soubor může být vykonáván v jediné reakci, spíše než čtyři potřebovaný s značený-přístup základu. Toto je provedené etiketováním každý dideoxynucleotide řetězu-terminators s odděleným světélkujícím barvivem, které fluoresces u různé vlnové délky. Tato metoda je snadnější a rychlejší než barvivo přístup základu, ale smět přinést více nerovného údaje vrcholy (různé výšky), kvůli šabloně závislý rozdíl v incorporation velkého barviva řetěz-terminators. Tento problém byl významně redukovaný se zavedením nových enzymů a barev, které minimalizují incorporation proměnlivost.
Tato metoda je nyní užitá na obrovskou většinu reakcí sekvenčního zpracování, zatímco to je oba jednodušší a levnější. Hlavní důvod pro toto je že základy nemusí být odděleně označen (který může být významné vydání pro jeden-používat zakázkový základ), ačkoli toto je méně znepokojení s často používaný ' univerzálie ' základy.
Automatizace a příprava vzorku
Moderní automatizované DNA sekvenční zpracování nástroje jsou schopné k sekvenci tolik jak 384 fluoresecently značených vzorků ve skupině (běží) a hraje tolik jako 24 běhů den. Tito hrají jen klížit oddělení a špičkovou četbu; aktuální sekvenční zpracování reakce (s), očista a resuspension ve vhodné vyrovnávací paměti musí být vykonáváni odděleně.
Vyrábět zjistitelné značené výrobky od šablony DNA, ' cyklovat sekvenčním zpracováním ' je nejvíce obyčejně hrál. Toto použití přístupu opakovala (25 - 40) kola základu annealing, DNA polymerase rozšíření a disassociation (tavení) šablonových DNA prvků. Hlavní výhody sekvenčního zpracování cyklu je více účinné použití drahého sekvenčního zpracování činidlo (BigDye) a schopnost k šablonám sekvence se silnými sekundárními strukturami takový jako vlásenky nebo GC-bohaté oblasti. Různé fáze sekvenčního zpracování cyklu jsou vykonávány tím, že změní teplotu reakce používat PCR teplotní cycler. Toto se spoléhá na skutečnost, že doplňující se DNA vůle anneal u snížit teploty a odloučit u vyšších teplot. Důležitá část výroby toto možný je použití DNA polymerase od organismu thermophillic, který není rychle denatured u vysoce (> 95C) zahrnuté teploty. V minulosti, nové DNA polymerase musely být přidal individuálně každý cyklus PCR.
Maxam-Gilbert sekvenční zpracování
U kolem stejný měřit to Sanger sekvenční zpracování metoda byla představena, Maxam a Gilbert vyvinul metodu DNA sekvenčního zpracování založeného na modifikaci chemikálie DNA následovaný jeho následujícím výstřihem [2]. Tato metoda byla zpočátku populární protože čištěný DNA mohl být používán přímo, zatímco počáteční Sanger metoda vyžadovala to každý četl začátek být klonován pro výrobu jeden-pletl DNA. Jako řetěz zakončovací metoda byla rozvinutá a zlepšená, Maxam-Gilbert sekvenční zpracování vypadávalo laskavosti kvůli jeho technické složitosti, potřebě použití riskantních chemikálií a potížím s měřítkem-nahoru.
Jiný DNA metody sekvenčního zpracování
Jiné techniky sekvenčního zpracování, které jsou ve vývoji, a smět nabídnout výhody přes konvenční metody, obsahovat:
- Sekvenční zpracování hybridizací
- Pyrosequencing
- nanopore sekvenční zpracování
Rozsáhlé sekvenční zpracování strategie
Aktuální metody mohou přímo sekvence jen krátké délky DNA v době. Například, moderní stroje sekvenčního zpracování použití Sanger metody může dosáhnout maxima asi 1000 párů základu [3]. Tato limitace je kvůli geometricky klesající pravděpodobnosti ukončení řetězu u rostoucích délek, stejně jako fyzické limitace na gelovatět velikost a rozhodnutí.
To je často nutné získat sled mnohem větších oblastí. Například, dokonce jednoduché bakteriální genomy obsahují milióny párů základu a lidský genom má více než 3 miliardy. Několik strategií bylo navržené pro velkoplošné DNA sekvenční zpracování, včetně chůze základu (vidět také chůze chromozómu) a sekvenční zpracování brokovnice. Tito zahrnují braní mnoho malý čtení DNA přes Sanger metodu a následovně shromažďovat je do sousedícího sledu. Různé strategie mají různé kompromisy v rychlosti a správnost; například, metoda brokovnice je nejpraktičtější pro sekvenční zpracování velké genomy ale jeho shromáždění zpracují je komplexní a potenciálně chyba-prone.
To je snadnější získat vysokého kvalitního sekvenčního údaje když požadovaný DNA je čištěný a zesílený od některého contaminants to může být v originálním vzorku. Toto může být dosažené skrz PCR jestliže to je praktická zkouška k základům designu, které pokryjí celou požadovanou oblast. Jinak, vzorek může být klonován používat bakteriální vektor, spojovat baktérie “růst” kopie toužil po DNA nemnoho tisíc párů základu v době. Většina rozsáhlého sekvenčního zpracování úsilí zahrnují přípravu velký knihovna takových klonů. Výhoda klonů sekvenčního zpracování přes PCR-produkty je že možnost přítomnosti nespecifických PCR produktů, které mohou způsobit hluk signálu je prakticky vyloučena.